瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質的一種電泳方法。其分析原理與其他支持物電泳最主要區別是:它兼有“分子篩"和“電泳"的雙重作用。瓊脂糖凝膠電泳中使用的溴化乙錠(EB)為中度毒性、強致癌性物質,務必小心。所以在實驗過程中一定要嚴格按照瓊脂糖凝膠電泳步驟操作。下面我們總結瓊脂糖凝膠電泳步驟,僅供參考。
1、按所分離的DNA分子的大小范圍,稱取適量的瓊脂糖粉末,放到一錐形瓶中,加入適量的0.5×TBE電泳緩沖液。然后置微波爐加熱至充分溶化,溶液透明。稍搖勻,得膠液。冷卻至60℃左右,在膠液內加入適量的溴化乙錠至濃度為0.5μg/ml。
2、取有機玻璃制膠板槽,有透明膠帶沿膠槽四周封嚴,并滴加少量的膠液封好膠帶與膠槽之間的縫隙。
3、水平放置膠槽,在一端插好梳子,在槽內緩慢倒入已冷至60℃左右的膠液,使之形成均勻水平的膠面。
4、.待膠凝固后,小心拔起梳子,撕下透明膠帶,使加樣孔端置陰極段放進電泳槽內。
5、在槽內加入0.5×TBE 電泳緩沖液,至液面覆蓋過膠面
6、把待檢測的樣品,按以下量在潔凈載玻片上小心混勻,用移液槍加至凝膠的加樣孔中。1μl加樣緩沖液(6×)+5μl待測DNA樣品〔+0.5μlEB 液(10mg/ml)(注:若膠內未加EB,可選用此法)。〕
7、接通電泳儀和電泳槽,并接通電源,調節穩壓輸出,電壓最高不超過5V/cm,開始電泳。點樣端放陰極-端。根據經驗調節電壓使分帶清晰。
8、觀察溴酚蘭的帶(藍色)的移動。當其移動至距膠板前沿約1cm處,可停止電泳。
9、染色:把膠槽取出,小心滑出膠塊,水平放置于一張保鮮膜或其他支持物上,放進EB溶液中進行染色,充分浸泡約30min。
10、在紫外透視儀的樣品臺上重新鋪上一張保鮮膜,趕去氣泡平鋪,然后把已染色的凝膠放在上面。關上樣品室外門,打開紫外燈(360nm或254nm),通過觀察孔進行觀察。
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